小分子抑制剂选择指南

2023/1/12 11:05:10  作者:阿拉丁生化


 小分子抑制剂是了解蛋白质功能及其在正常生理和疾病病理中的作用最容易获得和最通用的工具之一。为了在询问生物过程或验证新目标方面有价值,这些工具必须满足提供可靠和可重复数据的必要标准。由于有时很难从大量可用的分子中确定最合适的抑制剂,我们收集了一系列在选择过程中应该考虑的参数。

 

 

 

当你在研究中考虑使用每一种新的小分子时,必须注意它的1)化学性质,2)效力,3)选择性和4)使用环境。最好查阅科学文献,了解您所在领域的成熟工具以及某些化合物可能存在的优点和缺点(例如,细胞毒性或脱靶效应)。此外,对于每个产品阿拉丁提供相关的详细生物信息,以帮助您为您的实验选择正确的化合物。通常对于更新颖或相对未鉴定的抑制剂,最好自己进行初步测试,以了解化合物在实验系统中如何反应。虽然并非所有化合物在每种情况下都需要达到以下建议的阈值,但考虑这些参数将帮助您确定探针是否适合您的目的。
 

 

 

化学性质

 

 

结构

 

 

具有明确的化学结构,其合成方法应该是可复制的。避免常见的毒性部分和pan试验干扰部分(PAINS)。同样避免化学反应基团,除非需要,例如共价加成。

 

 

稳定性

 

 

应在相关介质中保持稳定性(纯度和化学特性),并注意pH敏感性。活动应保留在文化媒体。分子不应表现出非特异性的化学反应性(例如,氧化还原反应或膜不稳定)。

 

 

溶解度

 

 

在水介质中的溶解度应足够(例如,IC50的10倍或低% DMSO中的0.05 μg/ml)。溶解度和亲脂性都需要平衡。高电荷,高可溶性化合物可能显示低细胞或组织渗透性。疏水化合物可能表现出高渗透性和效力,同时存在溶解度问题。使用盐形式的疏水分子应提高水溶解度。

 

 

渗透性

 

 

通过被动或主动运输的渗透性对于细胞活性是必不可少的。血脑屏障穿透对于预期的中枢神经系统(CNS)效果很重要。Caco-2细胞渗透性测定或平行人工膜渗透性测定(PAMPAs)是评估被动扩散的常用测定方法。MDCK-MDR1渗透性可用于评估中枢神经系统渗透,包括p -糖蛋白(PGP)的主动外排。

 

 

 

 

效价

 

 

IC50 和 Ki

 

 

IC50和Ki是表示抑制剂效力的最常用方法。在酶抑制的背景下,IC50表示在给定的实验条件下将酶反应速率降低50%所需的抑制剂的浓度。Ki表示抑制剂-目标复合物分解(koff)与抑制剂-目标复合物形成(kon)的比值,用于抑制剂与酶的结合。术语Ki是一个热力学平衡常数,因此是一个固定值。另一方面,IC50是在一组确定的条件下的抑制作用的表示,并将根据反应环境中存在的底物浓度等因素而变化。对于竞争抑制剂,IC50可以通过Cheng-Prusoff方程与Ki相关:IC50=Ki*(1+[S]0/Km)。这是一个有用的基于网络的工具,可以使用不同的抑制剂结合模型将IC50值转换为Ki值。

 

 

 

注意,对于酶以外的蛋白质(如G蛋白偶联受体或离子通道),拮抗剂的功效也可以通过Ki或IC50来报告。在GPCRs的情况下,IC50(或通常EC50)是细胞反应抑制的指示(即cAMP浓度的降低),而Ki仅指与天然配体结合在受体上。

 

 

体外试验

 

 

体外药效基准标准通常为IC50或Ki值在生化测定中为100 nM,在细胞测定中为1-10 μM。酶测定的效力应与细胞中的效力相关。使用尽可能低的浓度,以避免脱靶效应。仅在浓度为10 μM时对细胞有效的抑制剂可能是非特异性靶向蛋白质。

 

 

体内试验

 

 

体内效力基准标准应达到目标组织中与细胞效力相关的水平。必须注意与化合物的吸收、溶解、代谢或排泄有关的影响。代谢稳定性是关键问题,如果该化合物将推进动物研究。

 

 

浓度依赖性

 

 

当使用低到高范围的推荐浓度进行实验时,剂量依赖性活性应很明显。在饱和浓度下对目标的近乎完全抑制证实了该化合物的功效。

 

 

构效关系

 

 

构效关系(SAR)分析可以解释一系列具有不同活性的化合物与一种酶或受体的结合,从而了解目标蛋白结合的要求、允许量和限制。SAR系列覆盖3-4个效能数量级是很重要的。一个“平坦”的合成孔径(SAR),即包含巨大结构差异的整个系列化合物都具有近乎等效的弱效力,可以表明给目标下药的难度增加。

 

 

 

 

可选择性

 

 

数据剖析

 

 

 

分析将定义对相关目标的选择性,这通常是一个比效力更关键的因素。通常情况下,在生化分析中,靶标的效力比其他家族成员强10-100倍的因素定义了一种抑制剂对该靶标的选择性。针对你感兴趣的目标设计的选择性抑制剂仍然可以在更高浓度下结合其他蛋白质。重要的是要了解任何与特定化学类相关的额外活动。

 

 

阴性对照

 

 

可以设计阴性对照实验,以证明该抑制剂在用于抑制所需靶标的浓度下,不会有效地改变任何脱靶蛋白的功能。经过充分考虑的阴性对照,如仅将细胞或蛋白质暴露于溶剂或替换密切相关的非活性结构类似物,如R/S立体异构体,有助于确认抑制剂的效果。

 

 

阳性对照

 

 

阳性对照实验可用于证明在效果不明显的情况下,抑制剂的行为符合预期。对照组不接受实验治疗,而是接受已知能产生预期效果的其他治疗。

 

 

正交探测器

 

 

具有相似活性但来自不同化学型和/或作用方式的正交探针也可考虑用作附加对照。如果正交探针产生类似的反应,则更有可能是对靶标的抑制导致了所观察到的表型。如果没有,那么混淆脱靶或毒性作用可能是由抑制剂引起的。

 

 

 

 

使用环境

 

 

作用机理

 

 

作用机制对于进一步定义抑制剂的性质非常重要,以便确定天然底物在生理浓度下如何调节抑制剂的功效,并确定与该机制相关的任何漏洞。潜在的抑制事件包括:

 

 

 

不可逆抑制-抑制剂

 

 

不可逆抑制-抑制剂通常通过共价附着结合酶,不可逆地使酶失活。虽然不可逆抑制剂通常是共价的,但非共价抑制剂有时可以很长时间地发挥不可逆抑制剂的作用。

 

 

 

可逆抑制剂

 

 

●   可逆抑制可以分解为以下几种:

 

 

●   竞争抑制-抑制剂和底物竞争自由酶,但每一个都阻碍了对方的结合,因为这种结合事件通常发生在目标的活性位点(正位位点),正是底物也结合的地方。

 

 

●   非竞争性抑制-抑制剂与游离酶和酶-底物复合物结合得同样好。虽然非竞争性抑制通常发生在变构位点,但非竞争性抑制也可以在结合正构位点时发生,通常在活性位点是双底物位点的情况下(酶与一种底物竞争,但与另一种底物不竞争)。

 

 

●   非竞争性抑制-抑制剂只能与酶-底物复合物结合,形成无活性的可逆三元复合物。非竞争性抑制是混合抑制的一种特殊情况。

 

 

●   混合抑制-抑制剂与酶的结合在自由酶和酶-底物复合物中不同。这种类型的抑制剂可能表现出对一种状态(非竞争性抑制)或另一种状态(竞争性抑制)的更大亲和力。

 

 

●   变构抑制-抑制剂结合到靶上的变构位点而不是活性位点,引起靶酶的构象变化,这是抑制所必需的。这些构象变化会影响通常酶-底物活性位点复合物的形成,破坏过渡态的稳定,或降低降低催化活化能的能力。

 

 

●   部分抑制-酶-底物-抑制剂相互作用产生的复合物比酶-底物复合物的周转率低。部分活性仍然存在,因为酶-底物-抑制剂复合物的催化中心可能保留一些在底物附近排列和促进催化的能力。

 

 

●   紧密结合抑制-最初的酶抑制剂复合物经历异构化形成第二个更紧密的复合物。紧密结合抑制剂倾向于显示非竞争性表型,即使它们可以以竞争性、非竞争性或非竞争性的方式与目标酶结合。因为这可以表现为缓慢增加的酶抑制,这是时间依赖的,传统的Michaelis-Menten动力学将给出一个错误的Ki值。通过分析kon和koff速率常数,可以得到更真实的Ki值。

 

 

●   时间依赖性抑制-抑制剂在酶周转的时间尺度上缓慢地与酶结合,这具有减缓观察到的抑制发作的效果。这可能导致催化剂速率常数(kcat)值变慢。

 

 

抑制物-靶点动力学

 

 

抑制物-靶点动力学,包括kon、停留时间和koff,为化合物的效力和选择性增加了额外的维度。与靶标缓慢解离的化合物在较低浓度时可能具有较长的活性,从而使剂量水平或剂量频率降低。通常停留时间比热力学效力更能与体内活性相关。

 

 

靶标易损性

 

 

目标脆弱性是观察到效果所需的目标参与的最低水平的函数。高易损性靶标需要较低水平的靶标占用(即较低水平的抑制剂暴露)才能达到预期效果。以细胞为基础的冲洗实验可以通过帮助确定一旦抑制剂从系统中移除,目标接触的表型后果,从而提供对目标脆弱性的深入了解。

 

 

生理环境

 

 

必须考虑目标的生理环境和目标交战的下游后果。例如,与该途径中的其他酶相比,破坏一种催化代谢途径中限速步骤的酶可能会产生更大的后果。在抗菌或抗癌的背景下,抑制生化途径的最后步骤,高能量/高成本生化产品的下游,可能被证明对目标细胞特别有毒。

 

 

时间范围

 

 

在设计试验时,应考虑预期表型效应或触发信号事件级联所需的时间范围,以相应地捕获这一时间长度。

 

 

补充实验

 

 

使用可用的RNAi或突变体的互补实验,在可用时,有助于就生物系统中给定目标的作用建立共识。

 

 

适应性

 

 

化合物对目标的应用适应性最终取决于它与所研究假设的生物学背景的联系程度,因为在一个生物系统中使用抑制剂不一定能推断出另一个生物系统。一种适合目的的抑制剂既适用于靶标,也适用于更广泛的科学背景。

 

 

可得性

 

 

该化合物的可用性是广泛的,并且可以获得后续使用的数量。

 

 

 

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